|
Арахидоновая кислота и пути ее выделения из природных объектов
Журнал "Химия природных соединений" Л. А. Якушева, Г. И.
Мягкова, И. К. Сарычева, Р. П. Евстигнеева
________________________________________
Дополнительно можно прочесть:
Wolf-H. Kunau. Chemistry and Biochemistry
of Unsaturated Fatty Acids. "Angewandte
Chemie"
Vol. 15. No 2. Febr. 1976. Pages 61-122 (djvu>>>>)
________________________________________
Арахидоновая кислота наряду с другими полиненасыщенными
кислотами является структурным компонентом липопротеидов
клеточных мембран и участвует в осуществлении ряда важнейших
биохимических процессов в клетке, обеспечивающих
жизнедеятельность организма. Возросший в последнее время интерес
к арахидоновой кислоте и методам ее получения обусловлен
превращениями этой кислоты в новый ряд ее биологически важных
метаболитов — простагландинов (ПГ), тромбоксанов (ТК),
лейкотриенов (ЛТ) и др. В основе процесса образования этих
метаболитов в живой клетке лежит ферментативное окисление
арахидоновой кислоты с последующим превращением в конечные
соединений. Тромбоксаны тесно взаимосвязаны с процессами
тромбообразования и кроветворения, лейкотриены участвуют в
аллергических (анафилактических) реакциях организма.
Простагландины, известные как внутриклеточные биорегуляторы
многих физиологически важных процессов, оказывают влияние на
сердечно-сосудистую, дыхательную, репродуктивную и другие
системы. Простагландины, тромбоксаны и лейкотриены найдут
широкое применение в медицине и ветеринарии. Уже сейчас описано
использование простагландинов для лечения гипертонии,
бронхиальной астмы, тромбозов сосудов, язвы желудка, в
гинекологии и др. [1]. Одним из перспективных путей получения
простагландинов Е2 и тромбоксанов А2 и В2,
простациклина I2 является их ферментативный синтез на
основе арахидоновой кислоты с помощью специфических
полиферментных комплексов, выделенных из различных источников
животного происхождения. Арахидоновая кислота (Δ4Аch) широко
распространена в животных тканях. Однако ее выделение осложнено
высокой чувствительностью к окислению, низким содержанием в
указанных объектах, а так же присутствием ее совместно с другими
полиеновыми кислотами, близкими по физико-химическим свойствам.
Различной степени чистоты, (87—96%) арахидоновая кислота в виде
ее метилового эфира была получена из надпочечников крупного
рогатого скота [2, 3], свиней [4]. В данной работе описаны
разработанные нами методы [5] выделения арахидоновой кислоты из
липидов поджелудочной железы крупного рогатого скота — отходов
эндокринного производства. Предложенные методы выделения
арахидоновой кислоты из липидных отходов действующего в
настоящее время производства эндокринных препаратов дают
возможность иметь не только ценный продукт, но создать
безотходное производство по ряду препаратов эндокринной
промышленности.
Выделение арахидоновой кислоты осуществляют через стадии
получения концентратов: жирных кислот (КЖК, 4,5% Δ4Аch),
ненасыщенных жирных кислот (КНЖК, 22,9% Δ4Аch),
метиловых эфир арахидоновой кислоты (К.м.э. Δ4Аchа,б,в);
метилового эфира арахидоновой кислоты (м.э. Δ4Аch) с последующим
омылением его в арахидоновую кислоту (схема).
Омылением липидов водно-спиртовой щелочью, подкислением и
экстракцией толуолом получают КЖК. Содержание арахидоновой
кислоты в полученном концентрате жирных кислот (табл. 1)
составляет 4,52%. В качестве основных примесей присутствуют
пальмитиновая (22,9%) и олеиновая (45,0%) кислоты. Отделение
этих насыщенной и моноеновой кислот осуществляют на основе
различных температур кипения эфиров жирных кислот, различной
растворимости жирных кислот в ацетоне и их соединений, включения
с мочевиной в метаноле при низких температурах.
Кристаллизацией из ацетона при —30° отделяют фракцию О1, (схема,
табл. 1), содержащую в основном пальмитиновую и стеариновую
кислоты, при —70° — фракцию О2, имеющую в своем составе главным
образом олеиновую кислоту. Таким образом, практически без потерь
арахидоновой кислоты получают КНЖК Δ4Аch 22,9% с примесью
олеиновой кислоты.
Концентрат эфира арахидоновой кислоты (к.м.э. Δ4Аch) можно
получить тремя путями (схема, табл. 1):
а) разгонкой метилового эфира КНЖК с фракциями Ф1 и Ф2 отделяют
метиловый эфир олеиновой кислоты и получают 43,5% к.м.э. Δ4Аchа
(с 76,2%-ным выходом по арахидоновой кислоте);
б) кристаллизацией при 20° комплексов включения с мочевиной КНЖК
отделяют олеиновую кислоту с фракцией О3 и получают после
метанолиза 42%-ный к.м.э. Δ4Аchб (с 78,5%-ным выходом по
арахидоновой кислоте);
в) кристаллизацией комплексов включения КНЖК с мочевиной
отделяют олеиновую кислоту (О3 фракция) при 20°. При —50°
исходит отделение олеиновой и в большей степени, чем при 20°,
линолевой, линоленовой, эйкозатриеновой, пентаеновой кислот. За
счет этого получаемый к.м.э. Δ4Аchв имеет повышенное содержание
Δ4Аch (54,5%) в сравнении с к.м.э. Δ4Аchа,б, и меньшее
содержание триеновых и пентаеновых кислот, что весьма
существенно при выделении высокопроцентных концентратов к.м.э.
Δ4Аch. Выход арахидоновой кислоты при способе в) — 65,3%.
Отделяемые фракции — отходы различных способов получен к.м.э.
Δ4Аch (Ф1, Ф2, О3, О4 содержащие соответственно 4,6; 15,0; 8,4;
20,5% Δ4Аch) — после их перевода в кислоты могут возвращаться в
процесс на стадии кристаллизации КЖК из ацетона при —700.
Таблица 1. Жирнокислотный состав (%) фракций при получении
концентратов метиловых эфиров арахидоновой кислоты.
|
Кислота |
КЖК* |
О1 |
О2 |
КНЖК |
Ф1 |
Ф2 |
О3 |
О4 |
Км.э.Δ4
Аcha |
Км.э.Δ4
Аchb |
Км.э.Δ4
Аchc |
|
1. Миристиновая и
др. низшие |
1,4 |
3,1 |
0,8 |
0,5 |
1,7 |
|
0,9 |
|
|
|
|
|
2. Пальмитиновая (16:1) |
22,9 |
58,6 |
8,4 |
6,4 |
20,4 |
3,2 |
7,7 |
2,7 |
|
1,0 |
|
|
3. Пальмитолеиновая (16:1) |
2,7 |
2,0 |
4,2 |
0,5 |
2,2 |
|
Сл. |
4,5 |
|
1,6 |
|
|
4. Пальмитолинолевая
(16:2) |
1,3 |
2,2 |
1,2 |
0,2 |
0,6 |
|
0,5 |
|
|
|
|
|
5. Пальмитоленоленовая
(16:3) |
1,1 |
0,7 |
2,8 |
Сл. |
|
|
Сл. |
|
|
|
|
|
6. Стеариновая (18:0) |
8,9 |
21,5 |
2,1 |
10,8 |
10,5 |
14,9 |
16,0 |
4,1 |
7,2 |
2,1 |
0,9 |
|
7. Олеиновая (18:1) |
45,0 |
8,2 |
73,2 |
41,7 |
54,8 |
52,1 |
60,5 |
24,8 |
26,0 |
16,1 |
12,6 |
|
8. Линолевая (18:2) |
6,1 |
3,7 |
7,3 |
7,0 |
4,5 |
7,7 |
3,3 |
17,0 |
8,0 |
12,9 |
10,6 |
|
9. Линоленовая (18:3) |
5,7 |
|
|
2,9 |
0,6 |
2,5 |
0,7 |
8,9 |
4,2 |
6,5 |
5,9 |
|
10. Эйкозаеновая (20:1) |
Сл. |
|
|
Сл. |
|
|
0,3 |
|
|
|
|
|
11. Эйкозадиеновая (20:2) |
Сл. |
|
|
Сл. |
|
|
0,5 |
|
|
|
|
|
12. Эйкозатриеновая (20:3) |
0,42 |
|
|
2,2 |
0,3 |
1,0 |
0,7 |
6,8 |
3,5 |
4,3 |
2,9 |
|
13. Арахидоновая (20:4) |
4,52 |
|
|
22,9 |
4,6 |
15,0 |
8,4 |
20,5 |
43,5 |
42,0 |
54,5 |
|
14. Изомер арахидоновой |
Сл. |
|
|
Сл. |
|
|
Сл. |
0,4 |
Сл. |
1,2 |
|
|
15. Эйкозапентаеновая
(20:5) |
0,96 |
|
|
4,9 |
0,8 |
3,6 |
0,5 |
10,9 |
7,6 |
12,3 |
11,6 |
|
Выход фракции
от жирных кислот, %
Выход
арахидоновой кислоты, % |
|
32,3
0,0 |
47,8
0,0 |
20,0
99,9 |
5,3
5,3 |
3,6
11,7 |
11,3
20,8 |
3,2
14,0 |
8,0
76,2 |
8,5
78,5 |
5,2
65,3 |
Выделение метилового эфира арахидоновой кислоты (м.э. Δ4Аch) из
полученных к.м.э. Δ4Аchа,б,в проводят либо методом адсорбционной
хроматографии на аргентированном силикагеле (вариант А, схема),
либо ректификацией с последующей хроматографией (варианты Б, В).
Так, хроматографической очисткой 42%-ного к.м.э. Δ4Аch на
аргентированном силикагеле получают 99,2% метиловый эфир
арахидоновой кислоты с выходом 60% (табл. 2, вариант А).
Фракционирование этого же к.м.э. Δ4Аchб при вакууме более 0,05
мм на ректификационной колонке с флегмовым числом 15 позволяет
выделить 93,5%-ный м.э. Δ4Аchб, примеси которого (метиловый эфир
эйкозатриеновой (4,3%), метиловый эфир тетраеновой
кислоты—изомера арахидоновой (1,0%), метиловый эфир пентаеновой
(1,2%) кислоты) практически полностью удаляются после очистки на
аргентированом силикагеле (табл. 2). Из к.м.э. Δ4Аchв,
содержащего меньшие количества примесей триеновой, изомера
тетраеновой и пентаеновой кислот по сравнению с к.м.э. Δ4Аchб
(см. табл. I), аналогичной ректификацией получают 97%-ный м.э.
Δ4Аch, колоночная хроматография которого дает 99,9%-ный
метиловый эфир арахидоновой кислоты.
Омылением 99,9%-ного метилового эфира арахидоновой кислоты
получают химически чистую арахидоновую кислоту. Отсутствие в УФ
спектре образца максимумов поглощения для сопряженных двойных
связей подтверждает устойчивость арахидоновой кислоты в
предложенных способах ее выделения. Выделенная кислота
охарактеризована физико-химическими и спектральными данными.
Полученные образцы арахидоновой кислоты были использован в
качестве субстратов простагландинсинтетазы микросом везикулярных
желез баранов при ферментативном синтезе ПГЕ2.
Таблица 2. Жирнокислотный состав (%) фракций при получении
арахидоновой кислоты.
|
Кислота |
Вариант А |
Вариант Б |
Вариант В |
|
Фракции, полученные при
колоночной хроматографии |
Ректификация |
Колоночная хроматография |
Ректификация |
Колоночная хроматография |
|
I |
II |
III |
IV |
V |
I |
II |
III |
IV |
I |
II |
III |
I |
II |
III |
IV |
I |
II |
III |
|
1. 16:0
2. 16:1
3. 18:0
4. 18:1
5. 18:2
6. 18:3
7. 20:3
8. 20:4
9. 20:4 изомер
10. 20:5 |
4,0
6,3
8,3
66,6
12,9
1,9
Сл. |
0,5
46,4
29,0
19,3
4,8 |
0,6
99,2
0,2 |
70,0
26,4
3,6 |
Сл.
100 |
3,8
5,7
7,3
52,1
22,6
8,5
|
13,2
31,7
22,9
11,7
19,8
0,7
Сл. |
4,3
93,5
1,0
1,2 |
13,5
Сл.
86,5 |
45,5
50,5
4,0 |
0,5
99,1
0,4 |
27,0
73,0 |
5,3
58,0
27,5
9,2 |
12,0
34,2
23,6
12,0
18,0 |
2,2
97,0
0,8 |
11,0
89,0 |
3,8
6,2 |
0,1
99,9 |
Сл.
99,9 |
|
Условия: % эфира в гексане
или Т кип. |
4,0 |
15,0 |
50,0 |
50,0 |
75,0 |
162-176 |
177-189 |
190-193 |
196-199 |
15-50 |
50 |
50-75 |
|
|
|
|
15-50 |
50 |
50-75 |
|
Выход фракций от КЖК, % |
2,04 |
1,66 |
2,7 |
0,36 |
1,07 |
2,0 |
1,5 |
2,8 |
1,0 |
0,22 |
2,4 |
0,04 |
0,83 |
0,75 |
2,38 |
0,65 |
0,13 |
2,1 |
0,01 |
|
Выход арахидоновой
кислоты, % |
0 |
3,3 |
60,0 |
4,7 |
0 |
0 |
6,7 |
58,0 |
3,0 |
2,5 |
52,7 |
0 |
0 |
3,1 |
51,0 |
1,5 |
1,7 |
48,5 |
0 |
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ТСХ осуществляли на силуфоле UV 254 (ЧССР) с использование
систем петролейный эфир — эфир (6:4) для жирных кислот и их
эфиров; бензол — диоксан — уксусная кислота (20:20:1) для
простагландина. Вещества на хроматограммах обнаруживали
опрыскиванием 2%-ным спиртовым раствором фосфорномолибденовой
кислоты с по следующим нагреванием при 100—120°. Для
хроматографии на колонках применяли силикагель Л 100/160. ГЖХ
осуществляли на хроматографе Chrom-4 (ЧССР), снабженном стальной
колонкой (200 см*2 мм), заполненной 10%
полиэтиленгликоль-адипинатом на хромосорбе W-AW-DMCS,
температура 200°, газ-носитель—гелий (30 мл/мин). ИК-спектры
снимали на приборе Perkin-Elmer-257 в пленке, ПМР спектры — на
спектрометре Bruker WP-60 (ФРГ) в CDC13; с
тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта, УФ-спектры —
на приборе Hitachi EPS-3T. Масс-спектры снимали на
хроматомасс-спектрометре LKB-2091 при энергии ионизирующих
электронов 22,5 эВ при прямом вводе в ионный источник при 100°
для простагландина Е2.
Концентрат ненасыщенных жирных кислот (КНЖК).
К эмульси 400 г концентрата липидов из отходов эндокринного
производства в 400 мл этилового спирта прибавляли 180 мл
40%-ного водного раствора едкого кали. Реакционную массу
перемешивали 3,5 часа при 40—45° в токе азота, охлаждали до
18—22°, добавляли 200 мл толуола и подкисляли 150 мл 60%-ной
серной кислоты до рН 2-3. Выпавший осадок отфильтровывали,
промывали 100 мл толуола. Органический слой фильтрата отделяли
от водного, экстрагировали водный слой толуолом (2x50 мл). Из
объединенных толуольных экстрактов (после обработки насыщенным
водным раствором метабисульфита натрия отгоняли растворитель и
получали 177,0 г концентрата жирных слот (КЖК, Δ4Аch 4,52%).
Раствор 177,0 г жирных кислот в 1200мл ацетона перемешивали 2 ч
при —30°. Выпавший осадок отделяли и с семикратным количеством
ацетона еще раз перемешивали 2 ч при -30°. 57,0 г осадка (О1)
отделяли, а фильтраты объединяли и прово¬ди подробное разделение
при —70°. Из конечного фильтрата удаляли ацетон и получали 35,3
г концентрата ненасыщенных жирных кислот (КНЖК Δ4Аch 22,9%).
Концентрат метилового эфира арахидоновой кислоты (к.м.э.
Δ4Аch).
а) 35,3 г КНЖК (Δ4Аch 22,9%) в 350 мл безводного метилового
спирта в присутствии 3,5 г хлористого ацетила перемешивали 1 ч
при —55°. Удаляли избыток метанола, реакционную массу
нейтрализовали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Вещество
извлекали толуолом. После отгонки растворителя остаток (33,2 г)
перегоняли при остаточном давлении 0,05 мм рт. ст. Получили три
фракции: 1 (Ф1) — 9,3 г. т. кип. 110—124°; II (Ф2) — 6,3 г, т.
кип. 124—140°, III (к.м.э.Δ4Аch) —14,2 г, т. кип. 141 —180° —
концентрат метилового эфира арахидоновой кислоты (Δ4Аch 43,5%);
б) 35,3 г КНЖК прибавляли к нагретому до 60—65° раствору 2,0 г
мочевины в 400 мл метилового спирта, перемешивали 20 мин и
оставляли на 10 ч. Осадок отделяли, фильтрат упаривали до
поло¬ны объема и вновь выпавший осадок объединяли с предыдущим
(О3). Полученный фильтрат подкисляли 30 мл 10%-ной соляной
кислоты до рН 2—3, а затем перемешивали в токе азота 45 мин при
40—45°, охлаждали и обрабатывали толуолом (3X50 мл).
Органические слои отделяли, растворитель удаляли. Остаток 16,1 г
в присутствии 160 мл безводного метилового спирта, 1,6 г
хлористого ацетила перемешивали при 50—55°. После обработки
получили 15,0 г концентрата метилового эфира арахидоновой
кислоты (к.м.э. Δ4Аchб, 42,0%);
в) 33,5 г КНЖК прибавляли к нагретому до 60—65° раствору 2,0 г
мочевины в 400 мл метилового спирта, перемешивали 20 мин.
оставляли на 10 ч. Осадок отделяли, фильтрат упаривали до
половины объема и вновь выпавший осадок объединяли с предыдущим
(О3). Фильтрат перемешивали 2 ч при — (50—45)°. Осадок (О4)
отделяли, а фильтрат подкисляли 28 мл 10%-ной кислоты до рН 2—3
после обработки получили 9,4 г концентрата арахидоновой кислоты,
раствор 9,4 г концентрата в 100 мл безводного метилового спирта
вприсутствии 1,0 г хлористого ацетила перемешивали 1 ч при
50—55°. После обработки получили 8,9 г концентрата метилового
эфира арахидоновой кислоты (к.м.э. Δ4Аchв, 54,5%).
Метиловый эфир арахидоновой кислоты (м.э. Δ4Аch).
А. 3,0 г кон¬центрата метилового эфира арахидоновой кислоты
(к.м.э. Δ4Аchб, 42,0%) в 10 мл смеси гексана и диэтилового эфира
(96:4), помещали в колонку, содержащую 90 г силикагеля
(100/160), импрегнированного AgNO3 (10%), и предварительно
промытую 50 мл смеси гексана и диэтилового эфира (96:4).
Продукты элюировали смесью гексана и диэтилового эфира (с
концентрацией эфира в гексане 4, 15, 50, 75%), собирая фракции
по 5—6 мл. Контроль осуществляли ТСХ
на аргентированном силикагеле. Во фракцию I объединяли элюаты,
содержащие в основном метиловые эфиры насыщенных и
мононенасыщенных кислот, во фракцию П — эфиры диеновой и
триеновой кислот, во факцию III—эфир арахидоновой кислоты, во
фракцию IV —эфир арахидоновой кислоты и ее изомер, фракцию V -
эфир пентаеновой кислоты. От фракции Ш отгоняли растворитель и
получали 1,01 г метилового эфира арахидоновой кислоты 99,2%-ной
чистоты.
Б. 11,2 г концентрата метилового эфира арахидоновой кислоты
(к.м.э. Δ4Аchб, 42,0%) фракционировали при 0,05 мм рт. ст. на
ректификационной колонке (1,0X18 см) со стеклянной насадкой с
флегмовым числом 15. Отбирали 10—15 фракций и контролировали их
(далее несколько строк пропущены)….
Метиловые эфиры насыщенных и моноеновых кислот - I фракция;
диеновых и триеновых — II фракция; тетраеновых — III фракция;
пентаеновых—IV фракция. Третья фракция (4,0 г) содержала 93,5%
Δ4Аch. 2,52 г полученного метилового эфира арахидоновой кислоты
в 10 мл 15%-ного диэтилового эфира в гексане помещали в колонку,
содержащую 50 г аргентированного селикагеля и прмытую 30 мл
диэтилового эфира в гексане (15%). Продукты эльюровали смесью
диэтилового эфира в гексане (в концентрации 15, 20, 50, 75%),
собирая фракции по 5—6 мл. Контроль проводили методом ГЖХ.
Фракции, содержащие Δ4Аch не менее 99,0%, объединяли (II
фракция, см. табл. 2). Растворитель удаляли. Получали 2.14 г
метилового эфира арахидоновой кислоты 99,1%-ной чистоты.
В. 9,4 г концентрата метилового эфира арахидоновой кислоты
к.м.э. Δ4Аch (54,5%) фракционировали на ректификационной
колон¬ке. Получали 4,2 г метилового эфира арахидоновой кислоты с
97,0%-ным содержанием. 2,1 г выделенного эфира очищали
адсорбционной хроматографией на аргентированном силикагеле.
Получали 1,75 г метилового эфира арахидоновой кислоты 99,9%-ной
чистоты.
Арахидоновая кислота (Δ4Аch). 1,75 г метилового эфира
арахидоновой кислоты (99,9%) в 45 мл смеси 5%-ного водного
раствора едкого натрия и этилового спирта (1:2) перемешивали в
токе азота 3 ч при 30—35°, охлаждали, подкисляли 2 н. серной
кислотой до рН 2. Вещество экстрагировали толуолом, промывали
водой до нейтраль¬ной реакции и насыщенным раствором
метабисульфита натрия. Су¬шили сульфатом натрия, растворитель
удаляли. После очистки на силикагеле получали 1,5 г арахидоновой
кислоты: d204 0,9245; n20D
1,4862; (лит. данные [6]: n20D 1,4848);
MRD 94,1. С20Н32О2; выч. 94,24;
вещество не имеет поглощения в УФ-спектре при 220—375 нм.
ИК-спектр (v, см-1): 3600-2400, 3020, 1710, 1640. Спектр ПМР(δ,
м. д.): 0,85 (т, ЗН, CH3), 1,30(м, 6Н, СН2-),
2.05 (м, 4Н, СН2С=С), 2,36 (м, 2Н, СН2СОО-),
2,83 (т, 6Н, С=ССН2С=С), 5,3 (т, 8Н, СН=СН, j=4Гц).
ЛИТЕРАТУРА
[1] М. Д. Машковский. Хим.-фарм. ж., № 7, 7 (1973).
[2] S. F. Herb, R. W. Riemenschneider, J. Donaldon. J. Am. Oil.
Chem. Soc, 28, N 2, 55 1951).
[3] Ю. Б. Пятнова, Л. Д. Смирнов, Л. В. Васильева, Г. И.
Мягкова, З. В. Гольцева, Р. П. Евстигнеева, И. К. Сарычева, Н.
А. Пре¬ображенский. Ж. общ. химии, 32, 142 (1962).
[4] О. S. Ргivett, R. P. Weber. J. Am. Oil. Chem. Soc, 36, # 10,
443 (1959).
[51 Г. И. Мягкова, Р. П. Евстигнеева, И. К. Сарычева, Л. А.
Якушева, Е. П. Богословская. А. С. 585152 СССР. Опуб.Б.И., №47,
с. 22 (1977).
[6] W.H. Kunau, H. Lehmann, R. Gross. Seyler's. Z. Physiol. Chem.,
352, 542 (1971).
|
