Белки из гороха

Белковые вещества из гороха

В растениях белки находятся во всех органах, во наиболее богаты ими семена. Иногда содержание так называемых резервных белков достигает 45—55%. Растительные белки, как и белки животных организмов, отличаются друг от друга по растворимости в воде и в растворах солей. Это позволяет разделять их на фракции. Семена гороха содержат от 22 до 34°/о белка. В состав его входит альбумин—легумелин (растворимый в воде белок) и два глобулина—легумин и вицилин (нерастворимые в воде, но растворимые в солевых растворах). В результате кислотного гидролиза белки расщепляются на аминокислоты, причем каждая фракция характеризуется определенным аминокислотным составом .

__________________________________________________
Сырьё и реактивы:
семена гороха ................. 100 г
хлорид натрия, сульфат аммония, ацетон, спирт,
эфир, соляная кислота, ацетатный буфер, фосфорный буфер.
__________________________________________________

Семена гороха (см. примечание 1) измельчают и, просеивая через грубое сито, удаляют кожуру. После этого делают тонкий помол и просеивают через шелковое сито (см. примечание 2). Измельчая горох, надо следить за тем, чтобы не было большого разогрева— оно может снизить выход белка. Выделение белка. 50 г гороховой муки экстрагируют в аппарате Сокслета эфиром до полного удаления жира. Сушат ее рассыпав слоем на листе фильтровальной бумаги. Затем муку переносят в стакан, заливают 500 мл 10-процентиого раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике при температуре не выше +4°. Вытяжку центрифугируют, прозрачный центрифугат насыщают сульфатом аммония и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок белков центрифугируют или отфильтровывают, отсасывая, суспендируют в воде и подвергают диализу для удаления солей и других низкомолекулярных примесей. Мешочек, в котором проводят диализ, готовят из квадратного тонкого листка целлофана (25 X 25 см), собирают его по краям вокруг оплавленной стеклянной трубки с чуть расширенным концом и прочно привязывают ниткой. Мешочек укрепляют в штативе, погружают в сосуд с проточной дистиллированной водой, наполняют приготовленной водной суспензией белка, затем приливают несколько капель хлороформа и толуола (в качестве антисептиков). Диализ проводят до полного удаления сульфат-иона (около 2 суток). В процессе диализа белки делятся на фракции, причем альбумин переходит в раствор, а глобулины остаются в осадке. Содержимое мешочка по окончании диализа переносят в пробирки. Центрифугированием отделяют раствор альбумина. Осадок глобулинов промывают (перемешивая) несколько раз растворами спирта возрастающей концентрации (50, 75, 90, 96%), сухим спиртом и, наконец, сухим эфиром, высушивают в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом и парафином и взвешивают ( примечание 3). Из прозрачного центрифугата легумелин осаждают ацетоном. Осадок промывают последовательно ацетоном, спиртом, эфиром и сушат в том же вакуум-эксикаторе. Сухой белок взвешивают. Осаждение легумелина можно осуществить также и кипячением раствора. Гидролиз белка. 0,2 г сухого белка помещают в колбочку емкостью 5 мл с пришлифованным восходящим холодильником (или трубкой), наливают 2 мл концентрированной соляной кислоты и 1 мл воды, следя за тем, чтобы весь белок пропитался кислотой. Колбочку нагревают на горячей бане до растворения белка (перемешивать не надо), а затем проводят гидролиз в течение 24 часов (можно с перерывами) на кипящей солевой бане. Гидролизат осторожно нейтрализуют 20-процентным раствором едкого натра до рН = 7 (индикатор универсальный) и анализируют хроматографией на бумаге. Хроматография гидролизата белка. Полосу хроматографической бумаги шириной 16—20 см и длиной 35—40 см погружают в ванночку с 1-процентным раствором трилона Б (см. примечание 4); при этом удаляются минеральные примеси. Затем хорошо промывают дистиллированной водой, высушивают и пропитывают буферным раствором, составленным из 72 мл раствора двухзамещенного фосфата натрия (11,9 г Na₂HPO₄ в 1 л воды) и 28 мл, однозамещенного фосфата калия (9,1 г KH₂PO₄ в 1 л воды); снова высушивают. На подготовленную таким образом бумагу наносят по две капли гидролизата белка и 2-процентные растворы аминокислот («свидетели»), входящие в состав белка гороха. Хроматографируют 15—20 часов по восходящему способу в растворителе, состоящем из н-бутилового спирта, воды и уксусной кислоты (соотношение 5:4:1). Хроматограмму просушивают на воздухе, опрыскивают 0,1-процентным раствором нингидрина в воднонасыщенном н-бутиловом спирте и выдерживают 15—20 минут в теплом сушильном шкафу. Появляются красно-фиолетовые пятна, по которым вычисляют Rf для аминокислот гидролизата и сопоставляют с Rf свидетелей. На этом основании делают заключение об аминокислотном составе исследуемого белка. Электрофорез на бумаге. Лист хроматографической бумаги кладут на стеклянную пластинку и вырезают вдоль волокон полосы (28X2,5 см), стараясь не трогать участки полос пальцами. На середине одной полосы микропипеткой наносят белковый гидролизат перпендикулярно к длине, на других — растворы «свидетелей» (по 100 мг чистых аминокислот в 100 мл раствора). Растворы надо нанести так, чтобы по обоим концам от линии нанесения оставались сухими 3 мм. Влажный след высушивают теплым воздухом от фена. Бумагу равномерно орошают ацетатным буфером с рН 3,8 (200 мл 1 н. раствора ацетата натрия + 170 мл 1 н. соляной кислоты доводят до 1000 мл) (см. примечание 5). Подготовленные полосы помещают в электрофоретическую камеру с тем же ацетатным буфером и проводят электрофорез в течение 17—17,5 часов; напряжение — 270 в. После разделения электрофорезом полоски бумаг высушивают при 90° в сушильном шкафу. Для окрашивания приготавливают основной раствор нингидрина следующим образом: 1 г перекристаллизованного нингидрина растворяют в 100 мл 96-процентного этилового спирта, прибавляют 1 г тонко растертого кристаллического хлористого олова, раствор перемешивают и отфильтровывают от нерастворившейся соли. Проявитель наливают в чашку Петри, протягивают через него высушенные электрофореграммы и раскладывают их на чистый лист фильтровальной бумаги (чтобы впитался стекающий раствор проявителя). Затем электрофореграммы в горизонтальном положении нагревают 10 минут до 90⁰ в сушильном шкафу в атмосфере, насыщенной парами воды; фиксируют положение проявившихся пятен. По полученным пятнам идентифицируют аминокислоты. Примечания. 1. Долго хранящиеся семена содержат мало извлекаемого белка.
2. Белок не способен диффундировать через клеточную стенку; извлекается только из механически вскрытых растительных клеток, поэтому выход его сильно зависит от степени помола.
3. Пользуясь неодинаковой растворимостью глобулинов в растворах сульфата аммония различной концентрации, можно разделить их на легумин н вицилин (см. Кретович В. Л. и др. Биохимия, 19, 208, 1954).
4. Трилон Б — кислая натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
5. Можно рекомендовать и другой способ. Полосы хроматографической бумаги равномерно орошают ацетатным буфером и раскладывают на чистый сухой лист фильтровальной бумаги. На середину этих полос накладывают узенькие бумажные полоски (1,5X0,2 см), смоченные соответственно исследуемым раствором гидролизата белка и 1-процентными растворами свидетелей. Подготовленные полосы переносят в электрофоретическую камеру.